Friday, Aug 29th

Last update09:50:03 PM GMT

Thuviensinhhoc.com Công nghệ sinh học Giáo trình nuôi cấy mô

Giáo trình nuôi cấy mô

Email In
Chỉ mục bài viết
Giáo trình nuôi cấy mô
Bài 2 : Kỹ thuật pha chế môi trường
Bài 3 : Gieo hạt Invitro
Bài 4 : Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Bài 5 : Nuoi cấy mô sẹo
Bài 6 : Khải sát sự phát sinh chồi tức các bộ phận khác nhau của cây thuốc lá
Bài 7 : Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo
Bài 8 : Đưa cây ra vườn ươm

Giáo trình nuôi cấy mô. Tập hợp 8 bài thực hành về nuôi cấy mô. Được sưu tầm, xin giới thiệu đến các bạn đồng nghiệp và các bạn học sinh, sinh viên.


BÀI 1:
MỞ ĐẦU



1.CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA MỘT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

a. Phòng rửa và cất nước
- Máy cất nước 1 lần
- Máy cất nước 2 lần

b. Phòng hấp – sấy
- Autoclave
- Tủ sấy 60 – 200oC

c. Phòng chuẩn bị môi trường
- Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
- Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
- pH kế
- Máy khuấy từ
- Tủ lạnh
- Lò vi sóng (microwave)

d. Phòng thao tác nuôi cấy

- Tủ cấy vô trùng (laminar)
- Quạt thông gió
- Đèn tử ngoại treo tường

e. Phòng nuôi cây
- Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang
- Máy điều hòa nhiệt độ
- Máy lắc nằm ngang
- Tủ ấm

f. Phòng thí nghiệm:
(phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hóa, phân tử và di truyền)
- Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần)
- Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần)
- Microtome
- Máy ảnh kỹ thuật số
- Hệ thống đèn chiếu
- Quang phổ kế …

2. CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Có 3 nhân tố chính:
- Bảo đảm điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy và xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.

2.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.

2.2 Nguồn tạp nhiễm

Có 3 nguồn tạp nhiễm chính:
- Dụng cụ thuỷ tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối
- Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường

2.3 Kỹ thuật vô trùng
2.3.1 Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh, nút đậy và môi trường
a. Dụng cụ thuỷ tinh

Thông thường các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm thường được xử lý bằng dung dịch sulfocromate một lần đầu trước khi đưa vào sử dụng; về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước cất và để thật ráo trước khi sử dụng.

Trong trường hợp các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi vô trùng, có thể khử trùng trong tủ sấy ở nhiệt độ cao trong nhiều phút hoặc nhiều giờ. Các dụng cụ này luôn được gói trong giấy nhôm hoặc hộp kim loại để tránh bị nhiễm trở lại sau khi đã khử trùng.

Bảng 1.1: Thời gian khử trùng dụng cụ thuỷ tinh bằng nhiệt và nhiệt độ khử trùng

Nhiệt độ (oC)                Thời gian khử trùng(phút)

160                                    45

170                                   18

180                                   7,5

190                                   1,5

b. Nút đậy

Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông gòn không thấm nước.Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất nhưng có các nhược điểm sau:

- Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ rất dễ bị nhiễm nấm, nhất là với những thí nghiệm tiến hành trong một thời gian dài

- Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên qui mô lớn
- Chỉ dùng được vài lần là phải bỏ

Hiện nay người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm bằng inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy…
c. Môi trường

Môi trường nuôi cấy thường được hấp khử trùng trong nồi hấp (autoclave), khử trùng bằng áp suất hơi nước bão hòa. Thời gian hấp từ 15-30 phút ở áp suất hơi nước bão hòa là 103,4 kPa (1atm) tương đương với nhiệt độ 1210C. Ở nhiệt độ 1210C, hầu hết các sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt, kể cả ở dạng bào tử. Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông để tránh bị nhiễm trở lại.

Bảng 2: Thời gian khử trùng dung dịch và các môi trường lỏng bằng nồi hấp (autoclave) ở 121oC tại 103,4 kPa

Thể tích môi trường (mL)                       Thời gian hấp khử trùng(phút)

<50                                                                  15

75                                                                    20

250-500                                                            25

1000                                                                 30

Việc hấp khử trùng bằng nồi hấp thì không thích hợp với nhiều hoá chất nhạy cảm với nhiệt độ như: các acid amin, các vitamin, các hormon tăng trưởng, và các chất kháng sinh. Các chất như vậy thường phải được khử trùng bằng cách lọc vô trùng. Màng lọc được làm bằng màng polyethylen hoặc sợI cellulose. Các lỗ trên màng siêu lọc này được thiết kế hiệu quả cho việc giữ lại các vi sinh vật gây nhiễm.

d. Lọc vô trùng

Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Một số loại màng lọc vô trùng của hàng Millipore. Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng 1 lần

Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa hịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25µm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong autoclave ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời cũng hấp vô trùng một bình huỷ tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc.

2.3.2 Khử trùng mô thực vật

Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ…tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Đòng lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật; ngược lại, lá, thân đặc biệt ở các bộ phận nằm sâu trong đất như rễ, củ… có lượng nấm, khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm, khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Lá khoai lang có thể vô trùng dễ dàng trong mùa khô nhưng không thể làm được trong mùa mưa. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30s trong rượu ethylic 70% sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời người ta thêm các chất giảm sức căng bề mặt như Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Để có khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy, xin dẫn tài liệu nghiên cứu của Street (1974) ở bảng sau:

Tác nhân vô trùng           Nồng độ %                   Thời gian xử lý            Hiệu quả ( phút)

Calci hypochlorit               9 – 10                              5 – 30                   Rất tốt

Natri hypochlorit              2                                      5 – 30                  Rất tốt

Hydro peroxid                10 – 12                              5 – 15                   Tốt

Nước Brom                    1-2                                    2 – 10                   Rất tốt

HgCl2 0.1 – 1                             2 – 10                   Trung bình

Chất kháng sinh             4 – 50 mg/l                         30 – 60                  Khá tốt

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa cẩn thận bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải được cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng của tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp ngoài cùng này sẽ được lột bỏ đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chăn sẽ đạt kết quả. Có thể dùng kháng sinh để kiểm soát hoặc loại bỏ sự nhiễm nấm trên mô cấy. Hầu hết các kháng sinh nhạy cảm với nhiệt do đó không thể hấp vô trùng. Chúng hoà tan được trong nước hoặc dung môi thích hợp khác, lọc vô trùng và thêm vào môi trường vô trùng khi môi trường này đã được làm nguội còn 45-50oC. Không phải tất cả các kháng sinh đều thích hợp cho sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Các kháng sinh như Streptomycin, Kanamycin và Neomycin thường độc cho mô thực vật và không hoạt động tốt trong một phạm vi pH nhất định. Tetracylin cũng là độc tố thực vật, có khuynh hướng ức chế sự tăng trưởng của mô thực vật sau khi bị xử lý trong một thời gian dài. Chloramphenicol có phổ hoạt động rộng nhưng độc cho thực vật (và người) ở nồng độ thấp. Các kháng sinh thường được dùng trong nuôi cấy mô thực vật gồm Rifampicin (thường được dùng kết hợp với các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin.

Các loại kháng sinh Khả năng hoạt động
Aminoglycoside :Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên các ribosome 30S hoặc 50S
-Streptomycin     
- Kanamycin
- Neomycin

Quinolone Gây trở ngại cho quá trình sao chép DNA bằng cách ức chế enzym DNA gyrase
- Nalidixic acid     
- Ofloxacin
- Norfloxacin

β-Lactam
- Penicillin          Ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn
- Ampicillin
- Carbenicillin

Tetracyclin Ức chế sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên ribosome 30S

Trimehtoprim và sulphonamide Ức chế sự sinh tổng hợptetrahydrofolate

Chloramphenicol Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S

Macrolide và lincosamide Ức chế sự sinh tổng hợp protein bằng cách tác động lên Rbx 50S
- Erythromycin
-Lincomycin

Glycopeptide Tác động lên sự sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.
- Vancomycin

Polymixin Gắn lên màng tế bào làm thay đổi dòng ion dẫn đến sự phá vỡ tế bào
- Polymixin B
- PolymicinE

Rifampicin Tác động lên RNA bằng cách gắn vào RNA polymerase

2.3.3 Kỹ thuật cấy vô trùng

Để tránh bị nhiễm trong suốt thao tác cấy mô thực vật, các nhà khoa học làm việc trong tủ cấy vô trùng (laminar). Đó là các tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào chỗ thao tác cấy. Tủ cấy vô trùng loại trừ một cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm từ bên ngoài và tạo điều kiện thoải mái chongười cấy, nên hiện nay được sử dụng rất phổ biếân trong các phòng thí nghiệm. Không khí từ bên ngoài được quạt hút vào qua một màng lọc thô. 99% bụi trong không khí được giữ lại ở màng lọc thô. Sau đó không khí được thổi qua màng lọc tinh và phân phối đều ra khắp bề mặt của tủ cấy, không tạo những xoáy không khí đưa bụi vào chỗ cấy. Màng lọc tinh ngăn cản các phần tử lớn hơn 0.3micron với hiệu quả 99,99% và do các hãng chuyên sản xuất màng lọc cung cấp. Tuổi thọ của màng lọc thô tuỳ theo số lượng bụi nơi làm việc, thường từ 6 tháng đến 1 năm và của màng lọc tinh từ 2 đến 3 năm. Khi thấy hiệu quả vô trùng của tủ cấy laminar kém đi thì cần phải thay màng lọc mới. Để kéo dài tuổi thọ của bộ màng lọc trong tủ cấy laminar- thường rất đắt tiền - nên bố trí tủ cấy trong các phòng riêng, càng ít bụi càng tốt.

2.3.4 Khử trùng nơi thao tác cấy và dụng cụ cấy

Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Phòng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên.

Trước khi đưa vào sử dụng, phòng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24h, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde còn thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24h. Bề mặt nơi chuẩn bị cấy, bề mặt bên trong và ngoài tủ cấy phải được khử trùng trước khi cấy bằng cách lau sạch các bề mặt này bằng cồn 90%.

Tia UV cũng có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt phòng cấy và tủ cấy nhưng nó ít hiệu quả hơn và nguy hiểm hơn là sử dụng cồn. Tia UV chỉ tiêu diệt được các mầm vi sinh nằm trực tiếp ngay trên các bề mặt mà tia này chiếu vào; nhưng nó không thể thấm qua các lớp bụi để tiêu diệt các vi sinh vật nằm bên dưới các lớp bụi này. Tia UV còn gây hại cho mắt và gây ung thư da. Các dụng cụ mang vào phòng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mủ vải, khẩu trang của người cấy đến dao, kéo, kẹp (forceps), giấy lọc, bình đựng nước cất...

Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy, người cấy cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy ần có một đèn tử ngoại 40W treo trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong phòng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ cho việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong thời gian cấy tránh đi lại ra vào phòng cấy quá nhiều.

Các dụng cụ bằng kim loại như kẹp cấy, dao mổ, que cấy vòng, kim mũi nhọn có thể được khử trùng bằng cách đốt dưới ngọn lửa đèn cồn. Những dụng cụ này trước hết phải được nhúng vào cồn tuyệt đối rồi mới đốt. Nhớ để ráo đi các giọt cồn thừa rồi mới đưa vào ngọn lửa đèn cồn. Khi mở nắp chai hoặc nắp ống nghiệm môi trường nuôi cấy, thì dùng ngón tay kế út và ngón tay út cầm lấy nắp gòn, và không chạm tay vào bề mặt bên trong của nắp gòn cũng như không thả nắp gòn xuống bất cứ bề mặt nào cho đến khi gắn nó trở lại chai môi trường.